Tecnologia do DNA Recombinante, rDNA

Até à década de 70, o DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado. A sua sequência de nucleótidos de enorme tamanho e monotonia química eram geralmente analisados por meios indirectos. A partir da década de 70, um conjunto de técnicas de análise e manipulação de DNA relacionadas com o isolamento e purificação de genes específicos revolucionou as ciências biológicas e teve impactos éticos e sociais. O DNA tornou-se, então, a molécula mais fácil de ser analisada, sendo possível isolar algumas das suas porções.

A tecnologia do DNA recombinante tem uma ampla aplicação. Ela pode ser usada no estudo de mecanismos de replicação e de expressão génica, na determinação da sequência de um gene e consequentemente da proteína que ele codifica, no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis como a insulina humana, vacinas ou enzimas industriais em grandes quantidades. Também no diagnóstico clínico, em terapia génica e no melhoramento genético de espécies animais e vegetais. A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular. Em traços muito gerais, o fragmento de DNA de interesse (inserto) é ligado a uma outra molécula de DNA (o vector) para se formar o DNA recombinante. Seguidamente, a molécula de DNA recombinante é inserida numa célula hospedeira compatível, num processo que se chama transformação. A célula hospedeira que recebeu a molécula de DNA recombinante é chamada de transformante. Um único transformante, em condições ideais, sofre imensos ciclos de divisão celular, produzindo uma colónia com milhares de cópias do DNA recombinante.

As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são enzimas capazes de seccionar o DNA em locais específicos, quando reconhecem uma pequena sequência específica de nucleótidos. Elas quebram as ligações fosfodiéster que unem nucleótidos consecutivos. Foram elas que permitiram desenvolver a tecnologia do rDNA, uma das metodologias indispensáveis na Engenharia Genética. 

Para se obter um DNA recombinante é necessário que uma determinada enzima de restrição corte o DNA em fragmentos que contenham o gene de interesse. Os fragmentos obtidos são incorporados num vector (uma molécula capaz de os transportar para uma célula) como é o caso dos plasmídios bacterianos. 

Para que o fragmento de DNA seleccionado seja incorporado no vector é necessário que a mesma enzima de restrição que actuou sobre o DNA inicial actue sobre o vector para expôr uma sequência nucleotídica complementar.

Neste caso específico, a molécula de DNA do plasmídio tem somente um local de clivagem para uma determinada enzima de restrição. A mesma enzima é usada para clivar o DNA humano. Os dois segmentos de DNA são ligados pela acção da DNA Ligase, produzindo uma nova molécula estável, o rDNA, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano. Este plasmídio híbrido pode ser inserido numa bactéria através da transformação e o inserto será, então, replicado como parte desse plasmídio.   

   

Replicação do DNA

Existiram três modelos teóricos possíveis para a replicação do DNA.

Meselson e Stahl, em 1957, confirmaram experimentalmente a replicação semiconservativa – cada cópia da molécula de DNA contém uma das cadeias da molécula original e uma cadeia que se formou de novo segundo a regra da complementaridade das bases.

Na replicação semiconservativa uma das duas cadeias da molécula de DNA que se forma deriva da molécula original e a outra é sintetizada de novo.

A replicação semiconservativa permite explicar a transmissão do programa genético e a relativa estabilidade da composição do DNA no decurso das divisões celulares.

A Estrutura do DNA

Em 1950, Rosalind Franklin realizou estudos a partir dos quais obteve dados sobre a estrutura do DNA, recorrendo à difracção de raios X. Quando um feixe de raios X incide sobre o material cristalizado (DNA cristalizado), o radiograma da difracção reflecte a configuração das partículas do cristal. A configuração em cruz indica que o DNA apresenta a forma de hélice. Através do microscópio electrónico, verificou-se que a espessura de uma molécula de DNA (2 nm) é dupla da de uma cadeia polinucleotídica (1 nm).

Na dupla hélice as duas cadeias de DNA são complementares (emparelhamento das bases por pontes de hidrogénio A = T e G º C) e antiparalelas (apresentam polaridades opostas - 5’ para 3’ numa cadeia  e 3’ para 5’ na outra). 

O grupo fosfato e a desoxirribose constituem a parte hidrofílica e estão localizados na parte externa da molécula. As bases azotadas constituem a parte hidrofóbica e estão na parte mais interna da molécula devido ao facto de serem apolares e a água uma substância polar.

A estrutura do DNA é a mesma em todas as espécies e é universal nos seres vivos. A grande diversidade de moléculas deve-se às diferentes combinações possíveis dos 4 nucleótidos do DNA, que podem variar em ordem e em número. 

A inesperada descoberta do DNA!

O DNA tem tido cada vez mais expressão nos trabalhos que envolvem a Biotecnologia e uma extrema importância na compreensão do funcionamento do organismo humano. O tema tem sido alvo de enormes descobertas que, para além de mediatismo, lhe conferem sempre um conjunto de novos motivos para descobertas seguintes. Um dos passos mais importantes, ocorreu em 1953, quando Watson e Crick, apoiados nos trabalhos de Chargaff, Rosalind Franklin e Wilkins, apresentaram o modelo da estrutura em dupla hélice para a molécula de DNA, tendo obtido o Prémio Nobel da Fisiologia e Medicina em 1962. Segundo este modelo, a molécula de DNA é constituída por duas cadeias polinucleotídicas complementares e antiparalelas.

Os nucleótidos são a unidade básica dos ácidos nucleicos (DNA e RNA) e cada um é constituído por 3 diferentes tipo de moléculas: uma base azotada, um grupo fosfato e um açúcar (uma pentose) que, no caso do DNA, é uma desoxirribose e, no caso do RNA, é uma ribose.